Отправлено: 06.10.20 11:32. Заголовок: Диагностика методом ПЦР. Мифы и реальность

Диагностика методом ПЦР. Мифы и реальность

Автор: Крылова Дарья Дмитриевна, молекулярный биолог, заведующая отделением ПЦР диагностики независимой ветеринарной лаборатории “Поиск”, г. Санкт-Петербург.

Для начала хотелось бы определиться, в чем же заключается смысл метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с практической точки зрения, с точки зрения ветеринарного врача. Что же должен точно понимать доктор, назначающий анализ методом ПЦР… Я не буду вдаваться ни в какие сугубо профессиональные подробности молекулярных механизмов, задействованных при проведении ПЦР. Хочется только, чтобы ветеринарный врач четко осознавал: метод ПЦР является прямым, и при проведении такого исследования предполагается, что из того клинического материала, который прислан в лабораторию, возможно выделить нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) предполагаемого возбудителя. Это является главным постулатом. Но, несмотря на этот постулат, я очень часто сталкиваюсь с мнением, которое я назову Мифом 1, о том, что любой возбудитель любого заболевания может быть обнаружен методом ПЦР в крови. Строго говоря, в данном случае кровь фигурирует как некий собирательный образ универсального материала для исследования. Часто от нас хотят, чтобы мы поработали «со всем и на все». Это невозможно, к сожалению. Как же определить, какой возбудитель может быть найден с помощью ПЦР, а какой нет? При отборе материала для исследования методом ПЦР доктор должен в первую очередь представлять себе патогенез заболевания или заболеваний, возбудителей которых он хочет обнаружить. Если прижизненный забор необходимого материала у животного невозможен, то не стоит назначать такую диагностику. В настоящее время в арсенале лабораторий есть множество доступных способов диагностики, например метод иммуноферментного анализа. Этот метод позволяет определить наличие антител к возбудителю, их количество и по определенным критериям с большой долей достоверности – статус заболевания. Для большей ясности можно рассмотреть конкретные примеры. В очередной раз остановимся на коронавирусе кошек и, конкретно, на инфекционном перитоните. В момент мутации вируса, находящегося в кишечнике кошки, он приобретает сродство к моноцитам. Заражая моноцит, вирус попадает в кровоток кошки, это бесспорный факт, но моноцит находится в кровотоке совсем недолго, в норме около 3 дней, а дальше он должен претерпеть свою окончательную дифференцировку в тканевой макрофаг. Поэтому моноцит вместе с коронавирусом уходит из кровотока через стенки сосудов в ткани, где становится макрофагом. Есть данные, что коронавирус еще и стимулирует ускоренную дифференцировку моноцита. Из этого следует, что коронавирус, несомненно, какое-то очень короткое время находится в периферической крови животного, и, конечно же, его можно там обнаружить, но это очень редкая находка, и диагностическая значимость исследования крови на наличие коронавируса методом ПЦР является нулевой, поскольку отрицательный результат такого исследования, к сожалению, не исключает наличия коронавирусной инфекции. Также иногда у доктора есть стремление найти в крови методом ПЦР парвовирус собак и кошек. Могу предположить, что такое желание основано на лейкопении, наблюдающейся при панлейкопении или парвовирусном энтерите. Вероятно, кто-то считает, что эта лейкопения является результатом уничтожения лейкоцитов вирусом непосредственно в кровотоке. Давайте рассуждать логически: парвовирус является ДНК-содержащим вирусом, а для успешного размножения и распространения ДНК-содержащему вирусу необходимо встроиться в геном хозяина, причем в клетки, активно делящиеся, иначе как вирус будет размножаться? Всем известно, что лейкоциты в норме в крови все же не делятся. А делятся их предшественники в костном мозге. Парвовирус поражает костный мозг, и лейкопения возникает в результате уничтожения клеток-предшественников в костном мозге. Также активно делящимися клетками являются клетки ворсин кишечника, где парвовирус успешно реплицируется, и самым хорошим материалом для исследования на парвовирусную инфекцию являются экскременты животного, с помощью которых вирус распространяется во внешней среде. В общем, коронавирус и парвовирус используют кровь только в качестве, условно говоря, транспортной среды для достижения конечной локализации и покидают кровоток достаточно быстро. Есть вирусы, которые вообще не выходят в кровоток. В качестве примеров можно привести калицивирус и герпесвирус кошек. Репликация этих вирусов чаще всего ограничивается лимфоидной тканью рото- и носоглотки. Калицивирусная инфекция может протекать системно, но это достаточно редкие и тяжелые случаи.

Раз уж речь пошла о вирусных инфекциях, хотелось бы отметить, что метод ПЦР очень точен и очень специфичен, но эта специфичность и лабильность генома вирусов, особенно РНК-содержащих, в реальности может привести к тому, что конкретная тест-система для исследования методом ПЦР может обнаруживать лишь какой-то определенный штамм или несколько штаммов конкретного вируса. В качестве примера опять-таки можно рассмотреть калицивирус кошек, который имеет огромное количество сильно отличающихся штаммов, а также постоянно обнаруживаемых новых изолятов. Поэтому, к сожалению, ПЦР-диагностика калицивируса дает много ложноотрицательных результатов.

Миф 2
Приоритетная значимость количественной ПЦР по сравнению с неколичественной
Количественная ПЦР является очень важным и мощным инструментом при мониторинге некоторых вирусных заболеваний. В диагностике человеческих вирусных заболеваний на настоящий момент валидировано несколько тест-систем для количественной оценки вирусной нагрузки вирусов гепатита В и С, а также вируса иммунодефицита человека. Это действительно важно для оценки лечения или поддерживающей терапии. Если говорить о животных, то количественная ПЦР также важна для оценки вирусной нагрузки у животного таких вирусов, как вирус иммунодефицита кошек и вирус лейкоза кошек. Однако доктор должен понимать, что количественная ПЦР возможна только в определенном материале, а именно в крови, поскольку отбор крови можно стандартизировать, плюс кровь является достаточно стабильной жидкостью организма. Количественная ПЦР на хламидиоз все же вызывает у меня некоторое недоумение. Не уверена, что так важно знать, например, количество хламидий, кроме того, это весьма затруднительно определить практически, поскольку невозможно универсально забрать несколько последовательных мазков. Врач не может быть уверен, что сегодня он забрал такое же количество конъюнктивального эпителия кошки, как и в прошлый раз. Мне кажется, что эффективность лечения хламидиоза у животного может быть вполне успешно оценена доктором визуально; при проведении ПЦР в реальном времени теоретически тоже достаточно хорошо видно, эффективно ли лечение, но тут возникает та же проблема, по которой результат количественной ПЦР может, мягко говоря, не соответствовать действительности – повторюсь – невозможность унифицированного забора. В общем, я бы не стала переоценивать значение количественной ПЦР в этих случаях, но если доктор все же решил, что он хочет действовать таким образом, тогда нельзя менять лабораторию в процессе мониторинга конкретного животного, поскольку универсальных валидированных тест-систем для количественной ПЦР в отечественной ветеринарии в настоящее время нет, и результаты, полученные в разных лабораториях, сравнить невозможно.

Миф 3
Значимость результата, полученного в «человеческой» лаборатории
Часто на форумах доктора из городов, в которых нет ветеринарных ПЦР-лабораторий, задают вопрос: как же все-таки провести диагностику на наличие возбудителя заболевания? К сожалению, бывают советы сдать анализ в «человеческую» лабораторию. И кто-то даже следует этим советам. Хочется еще раз повторить простую истину: большинство возбудителей у животных и человека все же различаются. В лаборатории, которая проводит исследования для людей, вам сделают анализ на хламидию, микоплазму, герпес человека. И еще, не дай бог, найдут все это в материале животного (такие случаи, к сожалению, нередки). На мой взгляд, если нет возможности провести исследование методом ПЦР в ветеринарной специализированной лаборатории, то лучше вообще не делать такого исследования, а проводить симптоматическое лечение.

Миф 4
Коммерческие лаборатории не работают с РНК
Для меня, скажу честно, это было откровением. Я слышала от многих людей, что лаборатория всегда и при всех обстоятельствах хочет только заработать, и для этого пойдет на любой обман. Вероятно, позиции прайсов об исследовании на разные РНК-содержащие вирусы также многими воспринимаются как обман. Хочется со всей ответственностью заявить, что конкретно наша лаборатория таким обманом не занимается, и мне кажется, что все остальные лаборатории тоже. Конечно, в силу многих факторов работа с РНК сложнее, чем с ДНК, но в настоящее время продаются прекрасные реагенты, значительно упрощающие жизнь при работе даже с такой нестабильной молекулой.

Миф 5
ПЦР может и должна быть дешевой
Нет, не может и не должна уж тем более. Для начала хотелось бы заметить, что постановка ПЦР представляет собой достаточно длительный и трудоемкий ручной процесс, требующий от человека, который этим занимается, высокой квалификации и понимания сложных механизмов. Но это лирика, естественно. Вторым немаловажным фактором является то, что реагенты для проведения ПЦР стоят дорого. Я не говорю о реагентике российского производства. К сожалению, ее качество такое, что, на мой взгляд, предпочтительнее и менее затратно получается пользоваться реагентами производства США и Европы. То есть я уверяю, что если хочется получать воспроизводимый адекватный результат и не иметь никаких осечек, то лучше не экономить. Исследование методом ПЦР в Англии, например, если перевести в рубли, стоит около 1500 рублей. А реагенты те же самые. Вероятно, там больше ценится труд специалиста, и есть понимание самого процесса. В нашей стране, к сожалению, многие врачи считают, что анализ в лаборатории полностью автоматизирован, а сотрудники только жмут кнопку. Работа мозга сотрудника лаборатории даже не рассматривается, нет осознания того, что не всегда все происходит по протоколу, и, чтобы опровергнуть или подтвердить диагноз доктора, люди выворачиваются наизнанку. Все стараются сдать анализ там, «где подешевле», не понимая, что качество при этом сильно теряется.

Миф 6
Лаборатория должна поставить диагноз
Справедливости ради стоит сказать, что такое бывает очень редко, но все же бывает. На мой взгляд, ответственность в постановке диагноза лежит целиком и полностью на враче. Лаборатория только помогает доктору подтвердить или опровергнуть его дифференциальные диагнозы. Ни один лабораторный метод не дает стопроцентной точности.

Миф 7
Если методом ПЦР не подтвердился ни один из дифференциальных диагнозов, значит, лаборатория плохая
Есть масса факторов, в силу которых можно получить ложноотрицательный или ложноположительный результат. Ошибиться могут все. И до 70% ошибок происходит в момент пробоотбора. У доктора в момент взятия материала на анализ, как правило, уже имеется мнение, чем болен пациент. И зачастую доктор абсолютно прав. Но если лаборатория выдает отрицательный результат, это не доказывает автоматически ее вину. Существуют универсальные правила забора материала, например, при подозрении на бактериальную инфекцию материал отбирают до введения антибиотиков. Если забор осуществили после двухнедельной антибиотикотерапии, то логично получить отрицательный результат, хотя у животного имелось именно то заболевание, которое предполагал доктор. Есть инфекции, адекватная диагностика которых требует временных и материальных затрат владельца. Например, возбудителя трихомоноза кошек можно не обнаружить в любой порции кала, для подтверждения диагноза требуется исследовать несколько образцов фекалий, собранных с интервалом в 8-12 часов. Часто владелец животного и врач считают это сложным. Да, они правы, но это не проблема лаборатории. При диагностике того же герпесвируса кошек нельзя отбирать материал после проведения флюоресцеинового теста, поскольку краситель, попавший в забранный материал, может заблокировать ПЦР. И это только несколько примеров среди огромного количества факторов, которые должны быть учтены врачом, желающим получить адекватный результат на свой запрос.

В заключение хотелось бы написать, что, к сожалению, у меня часто складывается впечатление некоего противостояния врачей и лаборатории, по крайней мере, в России. Врачи не доверяют лабораториям, лаборатории считают некомпетентными врачей, и т.д. Мне кажется, что такого противостояния быть не должно: лаборатория всегда должна помогать врачу, а для этого доктор должен делиться с ее сотрудниками полной информацией. Я могу точно сказать, что наша лаборатория старается помочь решить любую возникшую проблему, и мы всегда готовы обсудить какие-то непонятные моменты и произошедшие недоразумения.

Автор: Крылова Д. Д.
Рубрика: Лабораторные исследования